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血液/组织/细胞总RNA提取试剂盒(磁珠法)图片
产品货号:
WH0124
中文名称:
血液/组织/细胞总RNA提取试剂盒(磁珠法)
英文名称:
Magnetic Blood/Tissue/Cell Total RNA Extraction Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒采用具有独特分离作用的磁珠和独特的缓冲液系统,从各种组织、细胞、血液中分离纯化高质量总RNA。本产品可与Kingfi sher Flex96自动核酸提取仪完美契合,通过特制的磁棒吸附、转移和释放磁珠,从而实现磁珠和核酸的转移,提高了自动化程度。整个实验过程安全、便捷,提取的总RNA纯度高,没有基因组、蛋白和其它杂质的污染。如果需要高通量自动化提取,我公司可以提供整合方案。

使用本试剂盒纯化的RNA适用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游实验。

产品特点:
·本试剂盒即可满足手工提取也可适用于多种高通量平台批量提取。
·本试剂盒所得产物满足下游各类检测实验以及NGS分析。

试剂盒组成:
组分规格
裂解液RL30ml
去蛋白液RD48ml
漂洗液RW2×12ml
RNase-Free ddH2O15ml
磁珠悬浮液W2×1ml

储存条件:室温(15-25℃)干燥条件下,可保存12个月,更长时间的保存可置于2-8℃。该试剂盒中磁珠悬浮液W初次使用后建议置于2-8℃保存12个月。加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置1个月。

自备试剂:β-巯基乙醇、异丙醇、无水乙醇

选配试剂:DNase I (目录号:WH0051);10×红细胞裂解液H (目录号:WH0229);RNase-Free过滤柱CS (目录号:WH9007)

注意事项:(请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。)
1.操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如1ml裂解液RL中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配,配好的裂解液RL 4℃可放置1个月,裂解液RL在储存时可能会形成沉淀,如果有沉淀出现,请加热溶解后使用。
2.第一次使用前应在去蛋白液RD与漂洗液RW中加入无水乙醇,加入量请参见瓶上标签。

操作步骤:

一、组织/细胞总RNA提取
1.样本处理
①组织样本匀浆:
  注意:组织量不要超过20mg,否则可能导致RNA得率和质量下降。对于富含DNA的样本,如脾脏,建议使用5 mg。
  取新鲜或-80℃冻存的组织,液氮充分研磨成粉末状,称取5-20mg至装有450 μl裂解液RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇)的1.5 ml离心管(或者取适量组织加入裂解液后,电动匀浆),立即涡旋混匀,室温静置5min,12000rpm离心5min,小心吸取上清。
②细胞样本处理:
  a.悬浮细胞的收集(收集细胞数量请不要超过1×107):估计细胞数量,300×g离心5min,将细胞收集到离心管中,仔细吸除所有培养基上清。
  b.胰蛋白酶处理法:确定细胞数量,吸除培养基,用PBS溶液洗涤细胞,吸除PBS溶液,向细胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的PBS溶液处理细胞,当细胞脱离容器壁时,加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶,将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中,300×g离心5min,收集细胞沉淀,仔细吸除所有上清。
  注意:收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则会导致裂解不完全,影响RNA与磁珠的结合,造成RNA的产量降低。

裂解细胞
沉淀细胞数量裂解液RL
<5×106450μl
5×106~1×107600μl

2.取上述样本匀浆液450 μl,加入400 μl异丙醇和40 μl磁珠悬浮液W,振荡器混匀5min,使磁珠吸附RNA。
3.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去。
4.将离心管从磁力架上取下,加入900 μl去蛋白液RD(使用前检查是否加入无水乙醇),振荡混匀2 min。
5.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去,室温晾干5min。
6.(可选)将离心管从磁力架上取下,进行DNase I消化:5 μl DNase I,70 μl RDD缓冲液。将配好的工作液加入样本管中,室温放置15min,期间每5min颠倒混匀一次。
7.加入700 μl去蛋白液RD(使用前检查是否加入无水乙醇),振荡器混5min。
8.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去。
9.将离心管从磁力架上取下,加入700 μl漂洗液RW(使用前检查是否加入无水乙醇),振荡器混匀2 min。
10.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去。
11.重复步骤9和10一次。
12.短暂离心将残余溶液收集至管底,将离心管置于磁力架上,吸出所有液体弃去,室温晾干5min。
13.将离心管从磁力架上取下,加入50-100 μl RNase-Free ddH2O,60℃加热洗脱5min,期间颠倒混匀4-5次以充分洗脱RNA (或置于可加热的振荡器上洗脱)。
14.将离心管放置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心将RNA溶液转移至干净的离心管,继续后续实验或保存于-70℃~-80℃。

二、血液总RNA提取
本试剂盒仅适用于提取新鲜血液总RNA,不适用于冻存血。

1.红细胞裂解液的稀释:根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液H(例如待处理的血液样品体积为200 μl,则取140 μl 10×红细胞裂解液H),用RNase-FreeddH2O稀释至1×红细胞裂解液H。
2.向1倍体积新鲜全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H (需自备合适的干净管子)。
  注意1:为获得最佳的混匀效果,血液和1×红细胞裂解液H的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高,可按比例减小血液的使用体积,第7步中的裂解液RL的使用体积也要进行相应调整。
  注意2:此处新鲜全血仅指哺乳动物;禽类血由于红细胞含核酸,因此不需要进行此步骤,可以根据需求确定血液起始量直接进行全血裂解(即步骤7)。
3.在冰上孵育10-15min,在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。
  注意:在孵育的过程中溶液将变成半透明状态,表明红细胞裂解。如果必要的话,孵育时间可延长至20 min。
4.4℃条件下2,100 rpm (~400×g)离心10 min,将上清完全去除。
  注意:离心后白细胞可能会形成小球,确保完全去除上清。痕量红细胞的存在,会使白细胞小球呈现红色,而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。
5.向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H(加入1×红细胞裂解液H的体积是第1步中全血用量的2倍),重悬细胞。
6.4℃,2,100 rpm (~400×g)离心10 min,将上清完全去除。
7.向白细胞沉淀中加入裂解液RL(使用前请加入β-巯基乙醇),具体加量按照下表进行,涡旋或使用移液器混匀。
  注:如果血液不是健康人的全血,需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RL的体积,此时细胞应完全裂解,块状细胞沉淀消失。
健康人类全血白细胞数量裂解液RL
0.5ml<2×106400μl
0.5ml~1.5ml2×106~1×107600μl

8.(可选)将溶液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中),12000rpm(~13400×g)离心2 min,弃去过滤柱CS,收集滤液。
  注意:如果存在凝血点或片,建议进行此步骤,否则会影响后续核酸与磁珠的结合以及纯化。
9.取上述滤液加入1倍体积的异丙醇(通常为400 μl或600 μl)和40 μl磁珠悬浮液W,振荡器混匀5min,使磁珠吸附RNA。
10.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去。
11.将离心管从磁力架上取下,加入900 μl去蛋白液RD(使用前检查是否加入无水乙醇),振荡混匀2 min。
12.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去,室温晾干5min。
13.(可选)将离心管从磁力架上取下,进行DNase I消化:5 μl DNase I,70 μl RDD缓冲液。将配好的工作液加入样本管中,室温15min,期间每5min颠倒混匀一次。(或者使用振荡器振荡15min)。
14.加入700 μl去蛋白液RD(使用前检查是否加入无水乙醇),振荡器混匀5min。
15.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去。
16.将离心管从磁力架上取下,加入700 μl漂洗液RW (使用前检查是否加入无水乙醇),振荡器混匀2 min。
17.将离心管置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心吸出液体弃去。
18.重复步骤16和17一次。
19.短暂离心将残余溶液收集至管底,将离心管置于磁力架上,吸出所有液体弃去,室温晾干5min。
20.将离心管从磁力架上取下,加入50-100 μl RNase-Free ddH2O,60℃加热洗脱5min,期间颠倒混匀4~5次以充分洗脱RNA (或置于可加热的振荡器上洗脱)。
21.将离心管放置于磁力架上静置3 min,磁珠完全吸附后,小心将RNA溶液转移至干净的离心管,继续后续实验或保存于-70℃~-80℃。
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